1 拼音
W S / T 7 9 8 — 2 0 2 2 xiāo dú jì xiāo dú xiào guǒ dìng xìng shì yàn biāo zhǔn yìng yòng xī shì fǎ
3 基本信息
ICS 11.080
CCS C 59
中華人民共和國衛生行業標準《WS/T 798—2022 消毒劑消毒效果定性試驗標準 應用稀釋法》（Qualitative testing standard on disinfection effect of disinfectant——usedilutionmethod）由中華人民共和國國家衛生健康委員會于2022年01月24日發布，自2022年06月01日起實施。
4 發布通知
關于發布《現場消毒評價標準》等2項推薦性衛生行業標準的通告
國衛通〔2022〕2號
現發布《現場消毒評價標準》等2項推薦性衛生行業標準，編號和名稱如下：
現場消毒評價標準:WS/T 797—2022
消毒劑消毒效果定性試驗標準?應用稀釋法:WS/T 798—2022
上述標準自2022年6月1日起施行。
特此通告。
國家衛生健康委
2022年1月24日
5 前言
本標準由國家衛生健康標準委員會消毒標準專業委員會負責技術審查和技術咨詢，由中國疾病預防控制中心負責協調性和格式審查，由國家衛生健康委綜合監督局負責業務管理、法規司負責統籌管理。
本標準起草單位：北京市疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、中國人民解放軍疾病預防控制中心。
本標準主要起草人：佟穎、于禮、沈瑾、魏秋華、王勁、韓杰、安偉、肖瀟、高迪。
6 標準正文
6.1 1 范圍
本標準規定了消毒劑消毒效果定性試驗應用稀釋法的試驗材料、染菌載體的制備、中和劑鑒定試驗、殺菌試驗、結果判定和注意事項。
本標準適用于消毒劑對光滑硬質物體表面的實驗室定性消毒效果評價。
6.2 2 規范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
6.3 3 術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
3.1
應用稀釋法 use dilution method
采用定性方法評價消毒劑對不銹鋼圓筒載體上試驗微生物殺滅效果的檢測方法。
6.4 4 試驗材料
6.4.1 4.1 試驗微生物
4.1.1 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作為細菌繁殖體中化膿性球菌的代表，試驗菌種為ATCC 6538。
4.1.2 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作為醫院感染中常見分離的細菌繁殖體的代表，試驗菌種為 ATCC 15442。
4.1.3 腸炎沙門菌(Salmonella enterica)，試驗菌種為 ATCC 10708。
6.4.2 4.2 培養基
6.4.2.1 4.2.1 傳代培養基
6.4.2.2 4.2.2 中和試驗培養基
4.2.2.1 基礎培養液：營養肉湯或液體硫乙醇培養基，作為中和試驗的基礎培養基，見附錄A。
4.2.2.2 中和劑培養液：根據消毒劑有效成分選擇相應中和劑加入基礎培養基液中制備成為中和劑培養液，中和劑培養液需經中和劑鑒定試驗驗證合格后方可使用。
6.4.2.3 4.2.3 其他培養基
胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA），用于染菌載體的菌落計數，見附錄A.5。
6.4.3 4.3 其他試劑和材料
4.3.2 標準硬水(見附錄 A.7)。
4.3.3 有機干擾物：采用 3%牛血清白蛋白；如為清潔物品采用 0.3%牛血清白蛋白。
4.3.4 載體：304 不銹鋼圓筒，表面拋光，外徑 8 mm±1 mm，內徑 6 mm±1 mm，壁厚1 mm±0.5mm，長度 10 mm±1 mm。
4.3.5 吊鉤：長度為 50 mm～75 mm，直徑為 0.5 mm 的鎳鉻合金絲，末端3 mm 呈直角彎曲。
4.3.6 濾紙：直徑為 90 mm 的定性濾紙。
4.3.7 器皿：25 mm×100 mm 玻璃試管，直徑為 90 mm 的平皿，10 mL 吸管，移液器等。
6.4.4 4.4 儀器設備
Ⅱ級及以上生物安全柜、恒溫培養箱、振蕩培養箱、恒溫水浴箱、計時器等。
6.5 5 染菌載體的制備
6.5.1 5.1 載體準備
6.5.1.1 5.1.1 外觀檢查
載體經肉眼觀察合格，方可使用。如有可見破損如鈍化、缺口、凹陷或鑿孔等應剔除。
6.5.1.2 5.1.2 清洗
將載體置于1 mol/L NaOH溶液中浸泡約12 h，用去離子水反復沖洗3次～4次，收集沖洗水加入2滴～3滴1%酚酞溶液，如酚酞變為粉紅色，表明有NaOH殘留，需要繼續沖洗至酚酞不變色，將載體晾干后密閉保存。
6.5.1.3 5.1.3 篩選測試
6.5.1.3.1 5.1.3.1 測試要求
未使用過或使用過但試驗中無菌生長的載體，不需進行篩選測試，經壓力蒸汽滅菌后可使用。使用過的載體且在試驗中有菌生長，應進行篩選測試，測試合格方可使用。
6.5.1.3.2 5.1.3.2 測試方法
按照7.1規定，在無有機干擾物條件下，選用500 mg/L苯扎氯銨消毒液對銅綠假單胞菌消毒作用10min，以Letheen肉湯作為中和劑培養液，對每個載體進行殺菌試驗。
6.5.1.3.3 5.1.3.3 測試結果判斷
無菌生長為載體篩選測試合格，測試管中有菌生長，則該載體不合格。
6.5.1.4 5.1.4 滅菌
載體染菌前，將清洗后的載體放入試管中，加入去離子水至載體完全浸沒，經壓力蒸汽滅菌后，冷卻至室溫備用。
6.5.2 5.2 菌懸液的制備
5.2.1 參照 WS/T 683 的規定復蘇菌種，接種于含 10 mL 營養肉湯或合成肉湯的試管中，經36 ℃±1℃，200 r/min±20 r/min 振蕩培養 24 h±2 h，此為第 1 代培養物。
5.2.2 用移液器取第 1 代培養物 10 μL 轉種于含 10 mL 營養肉湯或合成肉湯的試管中，經36 ℃±1℃，200 r/min±20 r/min 振蕩培養 24 h±2 h，此為第 2 代培養物，可繼續傳代培養至第5 代。
5.2.3 用移液器取第 1～5 代的 24 h 新鮮培養物 10 μL 轉種于 10 個含 10 mL 營養肉湯或合成肉湯的試管中，經 36 ℃±1 ℃靜置培養 48 h～56 h 后備用。
5.2.4 銅綠假單胞菌培養物應去除培養菌液表面的菌膜，或使用 10mL 吸管直接從溶液中部吸取菌液，放入另一個試管中。不可使用含菌膜的菌懸液進行試驗。
5.2.5 將金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌和去除菌膜的銅綠假單胞菌培養菌液用電動混勻器振蕩混合20s，室溫靜置 10 min 后，用 10 mL 吸管吸取上層四分之三的菌液轉移至新的試管中混勻，以去除細菌碎片和團塊，菌懸液于 4 ℃冷藏保存備用，于 30 min 內使用。
5.2.6 根據消毒劑的檢測要求，按照 WS/T 683 的規定加入有機干擾物。
6.5.3 5.3 載體染菌
5.3.1 每次試驗時取 80 個無菌載體染菌，首先向 4 個無菌試管（25 mm×100 mm）中分別加入20mL制備好的菌懸液，依次向每管菌液中加入 20 個干燥無菌載體，確保載體完全浸沒于菌液中，持續15min±2 min。
5.3.2 用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余菌液，垂直放置于無菌的雙層濾紙上，置36℃±1 ℃恒溫培養箱內干燥 40 min±2 min 后，于 2 h 內進行試驗。
6.5.4 5.4 染菌載體菌落計數
5.4.1 隨機挑選 2 個染菌載體，分別放入 2 個含 10 mL 營養肉湯的 50 mL 離心管中，用電動混勻器劇烈振蕩混勻 20 s 進行洗脫，使用磷酸鹽緩沖溶液進行 10 倍系列稀釋。
5.4.2 選擇適宜的稀釋度,吸取 1 mL 加入無菌平皿中，將冷卻至 40 ℃～45 ℃的熔化營養瓊脂培養基，傾注于平皿中，平行接種于 2 個平皿，置 36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養48 h±2 h 后進行菌落計數。
5.4.3 每個染菌載體上金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收菌量為 1.0×106CFU/載體～1.0×107CFU/載體，腸炎沙門菌的回收菌量為 1.0×105CFU/載體～1.0×106CFU/載體。
6.6 6 中和劑鑒定試驗
6.6.1 6.1 試驗原則
通過中和劑鑒定試驗結果，判斷所選中和方法對消毒劑是否有效中和。若中和Ⅰ組顯示可有效中和，則僅使用中和劑培養液進行中和。若中和Ⅰ組結果顯示未完全中和，而中和Ⅱ組為有效中和，則在選用中和劑培養液進行中和的基礎上，再使用培養液進行二次中和。如仍顯示未完全中和，則繼續進行中和Ⅱ組試驗。試驗重復三次。
6.6.2 6.2 菌懸液的稀釋
6.2.1 取 1 mL 制備好的菌懸液加入 9 mL 磷酸鹽緩沖溶液中進行 10 倍梯度稀釋，取4 個稀釋梯度（舉例：10-4、10-5、10-6和 10-7）進行中和試驗。
6.2.2 同時取 4 個稀釋梯度各 1.0 mL 采用傾注法接種于 TSA 平板中，置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養 48 h±2 h 后，進行菌落計數。
6.6.3 6.3 中和Ⅰ組
6.3.1 試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。
6.3.2 選取 4 個無菌載體加入 10 mL 消毒劑溶液中，作用至規定時間后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余消毒液，分別轉移至 4 管含有 10 mL 中和劑培養液的試管中。
6.3.3 向上述 4 管中和劑培養液中分別接種 0.1 mL 4 個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置 36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養 48 h±2 h。
6.6.4 6.4 中和Ⅱ組
6.4.1 重復 6.3.1 和 6.3.2，載體在中和劑培養液中室溫靜置 30 min 后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余液體，分別轉移至 4 管含 10 mL 基礎培養液的試管中。
6.4.2 向上述 4 管培養液中分別接種 0.1 mL 4 個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1 ℃恒溫培養箱中培養 48 h±2 h。
6.6.5 6.5 陽性對照
未暴露于消毒劑的中和劑培養液和基礎培養液各4管，分別接種0.1 mL 4個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養48 h±2 h，作為陽性對照。
6.6.6 6.6 陰性對照
中和劑培養液和基礎培養液各1管加入無菌載體，不接種菌液，置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中培養48h±2 h，作為陰性對照。
6.6.7 6.7 結果判定
6.7.1 菌懸液濃度
菌懸液計數最后兩個稀釋梯度（如10-6和10-7），至少有一個稀釋梯度的菌懸液的數量在5 CFU/mL～100 CFU/mL范圍內。
6.7.2 陽性對照
基礎培養液管有菌生長表明試驗菌、培養液性能良好，中和劑培養液管有菌生長表明中和劑對試驗菌生長無明顯影響。
6.7.3 陰性對照
6.7.4 中和Ⅰ組
接種菌量較低（5 CFU/mL～100 CFU/mL）的中和劑培養液管中有菌生長，認定為中和劑可有效中和消毒劑，且中和產物對試驗菌生長無明顯影響。若無菌生長或僅在接種高濃度菌液的試管中生長表明未完全中和，或中和產物有抑菌作用，需進行中和II組試驗。
6.7.5 中和Ⅱ組
接種菌量較低（5 CFU/mL～100 CFU/mL）的培養液中有菌生長認為中和有效。
6.7 7 殺菌試驗
6.7.1 7.1 試驗步驟
7.1.1 用標準硬水配制消毒劑溶液至作用濃度，以每管 10 mL 分裝至 60 個無菌試管（25 mm×100mm）中，置于 20 ℃±1 ℃水浴中平衡 10 min。
7.1.2 用滅菌后的吊鉤以 20 s±5 s 間隔依次向每管消毒液中加入一個染菌載體，加入過程中勿觸碰管壁，輕柔振蕩 2～3 下后放入于 20 ℃±1 ℃水浴中。
7.1.3 消毒作用至規定時間后，用滅菌后的吊鉤依次鉤取染菌載體，輕觸管壁去除多余消毒液，轉移至 10 mL 中和劑培養液管中，加入時勿觸碰管壁。
7.1.4 振蕩混勻，置 36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中靜置培養 48 h±2 h。
7.1.5 若中和劑鑒定試驗結果顯示中和 I 組未完全中和，在中和劑培養液中靜置30 min 后用滅菌后的吊鉤將染菌載體取出后，轉移至基礎培養液管中，振蕩混勻后進行培養。
6.7.2 7.2 陽性對照
將未經消毒處理的染菌載體 2 個，分別放入 10 mL 中和劑培養液和 10 mL 基礎培養液管中振蕩混勻，置 36℃±1℃恒溫培養箱中靜置培養 48 h±2 h。
6.7.3 7.3 陰性對照
將無菌載體2個分別放入10 mL中和劑培養液和10 mL基礎培養液中振蕩混勻，置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱中靜置培養48 h±2 h。
6.7.4 7.4 試驗次數
試驗重復三次。
6.8 8 結果判定
陽性對照管應有菌生長，陰性對照管應無菌生長。消毒劑標注的消毒對象為光滑硬質物體表面時，對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的三次重復殺滅效果均應達到表1的要求，即金黃色葡萄球菌的殺滅試驗，陽性管數為0～3個，且陽性對照菌量對數值為6～7時，判定為合格，銅綠假單胞菌的殺滅試驗，陽性管數為0～6個，且陽性對照菌量對數值為6～7時，判定為合格。
| 試驗微生物 | 陽性管數（個） | 試驗管數（個） | 陽性對照菌量對數值 |
| 金黃色葡萄球菌 | 0～3 | 60 | 6～7 |
| 銅綠假單胞菌 | 0～6 | 60 | 6～7 |
| 試驗微生物 | 陽性管數（個） | 試驗管數（個） | 陽性對照菌量對數值 |
| 腸炎沙門菌 | 0～1 | 60 | 5～6 |
| 注：當消毒劑說明書標注對腸炎沙門菌有效時，增加腸炎沙門菌的殺滅效果試驗，對腸炎沙門菌的三次重復殺滅試驗，也應符合陽性管數為0～1個，且陽性對照菌量對數值為5～6的要求。 | |||
6.9 9 注意事項
9.1 金黃色葡萄球菌在試驗中可使用營養肉湯或液體硫乙醇培養基作為基礎培養液，Letheen肉湯對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。
9.2 同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，應按微生物種類分別進行中和劑鑒定試驗。
9.3 染菌載體轉移至消毒劑管時應避免觸碰管壁，嚴格無菌操作，操作中產生的微生物氣溶膠可能導致測試管假陽性。
9.4 在結果判定時，如培養液未出現混濁，但發生顏色變化或出現膜狀物，應與陽性對照對比來判定結果，并進行細菌的分離鑒定。
7 附錄A（規范性附錄）培養基和試劑
7.1 A.1 營養肉湯培養基
蛋白胨 10.0 g
牛肉膏 5.0 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水加至 1000 mL
以上各成分蒸餾水溶解，調 pH 至 7.2～7.4，于 121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min 備用。
7.2 A.2 合成肉湯培養基
L-胱氨酸 0.05g
DL-蛋氨酸 0.37g
L-精氨酸 0.40 g
DL-組氨酸 0.30 g
L-賴氨酸 0.85 g
L-酪氨酸 0.21 g
DL-蘇氨酸 0.50 g
DL-纈氨酸 1.00 g
L-亮氨酸 0.80 g
DL-異亮氨酸 0.44 g
DL-絲氨酸 0.61 g
DL-丙氨酸 0.43 g
L-谷氨酸 1.30 g
L-天冬氨酸 0.45 g
DL-苯丙氨酸 0.26 g
DL-色氨酸 0.05 g
L-脯氨酸 0.05 g
氯化鈉 3.00 g
氯化鉀 0.20 g
硫酸鎂 0.05 g
磷酸二氫鉀 1.50 g
磷酸氫二鈉 4.00 g
鹽酸硫胺素 0.01 g
煙酰胺 0.01 g
蒸餾水加至 1000 mL
以上各成分蒸餾水溶解，調 pH 至 6.9～7.3，于 121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫后，加入0.1 mL 無菌 10%葡萄糖溶液備用。
7.3 A.3 液體硫乙醇培養基
酪蛋白胨 15.0g
酵母粉 5.0 g
葡萄糖 5.0 g
硫乙醇酸鈉 0.5 g
L-胱氨酸 0.5 g
氯化鈉 2.5 g
刃天青 0.001 g
蒸餾水加至 1000 mL
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調 pH 至 6.9～7.3，分裝于 115 ℃壓力蒸汽滅菌20 min 備用。
7.4 A.4 Letheen 肉湯培養基
酪蛋白胨 10.0 g
牛肉膏 5.0 g
吐溫-80 5.0 g
卵磷脂 0.7 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水加至 1000mL
以上各成分蒸餾水溶解，調 pH 至 6.8～7.2，于 121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min 備用。
7.5 A.5 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）
胰蛋白胨 15.0 g
大豆蛋白胨 5.0 g
氯化鈉 5.0 g
瓊脂 16.0 g
蒸餾水加至 1000 mL
以上各成分蒸餾水溶解，調 pH 至 7.2～7.4，于 121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min 備用。
7.6 A.6 磷酸鹽緩沖液 （PBS，0.03mol/L）
無水磷酸氫二鈉 2.83 g
磷酸二氫鉀 1.36 g
蒸餾水加至 1000 mL
以上各成分蒸餾水溶解，待完全溶解后，調pH至7.2～7.4，于121 ℃壓力蒸氣滅菌20 min備用。
7.7 A.7 標準硬水 (硬度 342 mg/L)
氯化鈣 0.034 g
六水氯化鎂 0.139 g
蒸餾水加至 1000 mL
